سیدعلی خامنهای تحصیل را در چهار سالگی از مکتبخانه و با فراگیری قرآن کریم شروع کرد. دورهی دبستان را در نخستین مدرسهی اسلامی مشهد، دارالتعلیم دیانتی، گذراند . در همین ایام، یادگیری قرائت و تجوید قرآن را نزد برخی قاریان قرآن مشهد آغاز کرد .
همزمان با تحصیل در کلاس پنجم دبستان، تحصیلات مقدماتی حوزوی را نیز آغاز کرد. شوق وافر او به تحصیلات حوزوی و تشویق والدین سبب شد که وی پس از اتمام دورهی دبستان، وارد دنیای طلبگی شود و تحصیل علوم دینی را در مدرسهی سلیمانخان ادامه دهد. وی بخشی از مقدمات را نیز نزد پدر طی کرد. سپس به مدرسهی نواب رفت و دورهی سطح را در آن به پایان برد. همزمان با تحصیلات حوزوی دورهی دبیرستان را تا سال دوم متوسطه ادامه داد .
وی معالمالاصول را نزد آیتالله سیدجلیل حسینی سیستانی و شرح لمعه را نزد پدر و میرزا احمد مدرس یزدی فرا گرفت. رسائل، مکاسب و کفایه را نیز نزد پدر و آیتالله حاج شیخ هاشم قزوینی آموخت. در سال ۱۳۳۴ش، در درس خارج فقه آیتالله سید محمدهادی میلانی حاضر شد.
معرفی دوره
تحصیل در مشهد
حوزه نجف
وی در ۱۳۳۶ش طی سفر کوتاهی همراه خانواده به نجف اشرف مشرف شد و در دروس مدرسان بنام حوزهی علمیهی نجف، از جمله آیات سید محسن حکیم، سید ابوالقاسم خویی، سید محمود شاهرودی، میرزا باقر زنجانی و میرزا حسن بجنوردی حضور یافت، ولی به دلیل عدم تمایل پدر برای اقامت در آن شهر به مشهد بازگشت و به مدت یک سال دیگر در درس آیتالله میلانی حاضر شد. سپس در سال ۱۳۳۷ش به شوق ادامه تحصیل عازم حوزهی علمیهی قم شد . در همین سال و پیش از عزیمت به قم، آیتالله محمدهادی میلانی به وی اجازهی روایت داده بود .
حوزه قم
در سال ۱۳۴۲ و در آستانهی ماه محرم، امام خمینی وی را مأمور ساخت پیامهایی را به آیتالله میلانی و علما، روحانیون و هیأتهای مذهبی خراسان در جهت تداوم نهضت و آگاهسازی مردم در قبال تبلیغات رژیم پهلوی انتقال دهد. امام خمینی در این پیامها خطمشی مبارزه را ترسیم کرده و از علما و روحانیون خواسته بود به منظور تبیین جنایات رژیم پهلوی، ذکر واقعهی مدرسهی فیضیه از روز هفتم محرم در منابر خوانده شود . آیتالله خامنهای خود نیز برای محقق ساختن هدف و اجرای خطمشی امام خمینی راهی بیرجند ــ که تحت نفوذ خاندان علم بود ــ شد 
و در منابر و مجالس آن شهر دربارهی حادثهی مدرسهی فیضیه و سلطهی اسرائیل بر جوامع اسلامی سخنرانی کرد . به دنبال این سخنرانیها، وی در ۱۲ خرداد ۱۳۴۲ مقارن با هفتم ماه محرم ۱۳۸۳، دستگیر و در مشهد زندانی شد . پس از آزادی وی، آیتالله محمدهادی میلانی از او دیدن کرد . آیتالله خامنهای پس از آن با حضور در جلساتی که در منزل آیتالله میلانی به منظور تداوم نهضت اسلامی در غیاب امام خمینی ــکه در حصر به سر میبرد ـ تشکیل میشد، فعالیتهای سیاسیاش را تداوم بخشید . اندکی پس از آن به حوزهی علمیهی قم بازگشت و با کمک و همکاری برخی روحانیون مبارز به سازماندهی مجدد فعالیتهای سیاسی از طریق جلسات مشورتی و تبلیغات پرداخت . او از جمله روحانیونی بود که در ۱۱ دی ۱۳۴۲ تلگرامی به آیتالله سید محمود طالقانی، مهدی بازرگان و یدالله سحابی، که در حمایت از امام خمینی زندانی شده بودند، فرستاد . در همان زمان طلاب خراسانی حوزهی علمیهی قم با هدایت او، در اعتراض به ادامهی حصر امام خمینی نامهای به حسنعلی منصور، نخستوزیر وقت، نوشته و منتشر کردند که از جملهی آنها خود ایشان و ابوالقاسم خزعلی و محمد عبایی خراسانی بودند .
بازگشت به مشهد
آیتالله خامنهای در ۱۳۴۳ش به دلیل عارضهی بینایی پدر و کمک به وی به ضرورت از قم به مشهد بازگشت و بار دیگر در جلسات درس آیتالله میلانی حضور یافت که تا سال ۱۳۴۹ ادامه داشت. او از ابتدای حضور در مشهد، به تدریس سطوح عالی فقه و اصول (رسائل، مکاسب و کفایه) و برگزاری جلسات تفسیر برای عموم همت گماشت. در این جلسات جمعیت کثیری از قشر جوان به ویژه دانشجویان حضور پیدا میکردند. در جلسات تفسیر خود، مهمترین پایههای فکری اسلام و اندیشه اسلامی را از خلال آیات قرآن استخراج و بیان مینمود و به تعمیق بنیانهای اندیشه مبارزه و براندازی حکومت طاغوت میپرداخت به صورتی که شرکتکننده در درس تفسیر او به این نتیجه ضروری و طبیعی میرسید که حکومتی بر پایه اسلام و معارف دین باید در کشور تحقق یابد. یکی از اهداف اصلی او از تفسیر، انتقال مبانی انقلاب اسلامی به جامعه بود از سال ۱۳۴۷ درس تخصصی تفسیر را نیز برای طلاب علوم دینی شروع کرد که این دروس و جلسات تفسیر تا سال ۱۳۵۶ و قبل از دستگیری و تبعید به ایرانشهر ادامه داشت . جلسات تفسیر در سالیانی از دوره ریاست جمهوری و پس از آن ادامه داشت.
شخصیت ادبی
آیتالله خامنهای با حوزهی شعر و ادبیات مأنوس هستند و همواره به مطالعه رمان و داستان علاقمند بودهاند و بسیاری از رمانها و داستانهای
معتبر دنیا را مطالعه کردهاند. این علاقه با مطالعه رمانها و آثار ادبی نویسندگان بزرگ جهان و تاریخ و فرهنگ ملل شرق و غرب تداوم پیدا کرد. حتی به نقد کتابهای ادبی و شعر هم میپردازند. با بسیاری از شاعران، نویسندگان و روشنفکران زمانه در ارتباط بود.
در ایامی که در مشهد حضور داشت در برخی از انجمنهای ادبی که با حضور شعرای بزرگ تشکیل میشد شرکت میکرد. در انجمنهای ادبی به نقد شعر میپرداخت. خود نیز اشعاری سروده و در سالهای اخیر تخلص «امین» را برگزیده است. مطالعهی کتب تاریخی بخش دیگری از برنامهی مطالعاتی دائمی ایشان است و به مباحث و موضوعات تاریخ معاصر احاطه دارند.